毒力蛋白Apyrase和染色体编码的亚复合物形成毒力复合物对细菌胞间扩散的影响

【摘要】志贺氏菌(Shigellaflexneri)5aM90T是一类具有高度传染性和严重危害的革兰氏阴性杆菌,是导致人类腹泻的最为常见的病原菌。比较基因组学表明志贺氏菌可能是由非致病性大肠杆菌通过趋同进化而来,并且通过基因水平转移获得了一个毒力大质粒从而变成致病菌。志贺氏菌在致病过程中所需的大多数蛋白都是由毒力大质粒编码的,包括膜蛋白复合物Ⅲ型分泌系统(T3SS)。本课题要考察的是,在志贺氏菌的细胞膜上是否还有其它毒力相关膜蛋白复合物呢?为了回答这个问题,我们利用BN/SDS-PAGE比较志贺氏菌5aM90T野生株和毒力大质粒缺失株的膜蛋白复合物谱,发现了一个野生株特有的膜蛋白复合物,将之命名为M90T-290。然后通过SDS-PAGE分离和质谱鉴定M90T-290的蛋白组成,发现它是由大质粒编码的Apyrase和染色体编码的ClpB、DnaK、YdgA、EF-TU、GapA组成。查阅文献发现,其中两个组成蛋白Apyrase和DnaK都与毒力蛋白VirG的极性分布有关。推测膜蛋白复合物M90T-290是毒力相关的膜蛋白复合物。本文通过提取复合物各亚基的缺失突变株天然结构的膜蛋白复合物,BN-PAGE分离膜蛋白复合物,观察BN-PAGE条带的变化,发现△ydgA、△phoN2、△dnaK较野生株缺少了M90T-T290,△clpB并不影响M90T-290的形成。说明Apyrase.DnaK.YdgA是膜蛋白复合物M90T-290的必需组成成分,C1pB不是M90T-290组成成分。为了进一步确定复合物各亚基的相互作用关系,利用Pull-down实验分析,结果表明复合物各亚基间存在广泛的两两相互作用。然后考察了M90T-290是否影响细菌的毒力。通过HeLa细胞侵袭实验和豚鼠角膜实验发现,与野生株和相应的回复株相比,缺失了复合物M90T-290的突变株△ydgA.△phoN2.△dnaK的毒力明显减弱,表明复合物M90T-290是福氏志贺氏菌5aM90T的发挥毒力功能所必需的。复合物M90T-290是否通过影响VirG极性分布和宿主细胞中actin的聚集发挥毒力呢?为了回答这个问题,利用免疫荧光实验分析了复合物各亚基缺失株对VirG极性分布和宿主细胞中actin聚集的影响。结果显示在△phoN2、△dnaK中VirG不能极性分布,而△ydgA中VirG仍以极性分布。这说明Apyrase和DnaK这两个蛋白是VirG的极性分布所必需的,跟是否形成复合物没有关系,即复合物M90T-290存在与否不影响VirG的极性分布。志贺氏菌缺失phoN2.dnaK和ydgA后,聚集actin的能力丧失,进而无法在胞内和胞间扩散。产生这种结果有两种可能的机制：1、Apyrase、DnaK和YdgA形成复合物影响actin的聚集；2、其中某个蛋白影响了actin的聚集,另外两个蛋白影响这个蛋白的表达调控。我们的实验结果表明phoN2、dnaK和ydgA不存在表达调控关系,排除了第二种可能性,说明是Apyrase、DnaK和YdgA形成复合物影响actin的聚集。最后,通过对志贺氏菌膜蛋白复合物图谱的进一步分析和质谱鉴定,发现了一个由染色体编码蛋白DnaK、YdgA、EF-TU和GapA形成的亚复合物,命名为M90T-260。这个亚复合物M90T-260的形成不依赖于毒力蛋白Apyrase,并且在体内和体外实验都可以结合重组表达的Apyrase形成的全复合物M90T-290。综上所述,我们发现了一个福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)5aM90T所特有的膜蛋白复合物M90T-290,由毒力蛋白Apyrase结合染色体编码的亚复合物形成,后者由DnaK、YdgA、EF-TU和GapA蛋白组成。该复合物的缺失会导致细菌毒力的降低。其发挥毒力的机制是与另一个毒力蛋白VirG协同影响actin的聚集,促进志贺氏菌在胞内和胞间扩散。本研究不但发现了志贺氏菌毒力相关的膜蛋白复合物,初步阐述毒力机制,而且作为首次发现的染色体与毒力大质粒编码蛋白形成复合物协同发挥毒力功能的例子,为志贺氏菌染色体与毒力大质粒间的协同进化提供了新的证据,揭示了毒力进化的一种新机制。
【作者】王羽；
【导师】呼和巴特尔；廖翔；梁龙；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】志贺氏菌；比较蛋白组学；膜蛋白复合物；BN/SDS-PAGE；

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